O trabalho vem sendo conduzido no Laboratório de Virologia (LIM52) do Instituto de Medicina Tropical (IMT-USP), sob o comando da virologista Lucy dos Santos Vilas Boas.

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“Recebemos a amostra clínica do primeiro paciente diagnosticado no país e a inoculamos em uma cultura de células vero [linhagem oriunda de rim de macaco e usada como modelo para pesquisas com vírus]. Após 24 horas, já era possível observar alterações morfológicas nas células que são típicas do monkeypox. A confirmação foi feita por RT-PCR”, conta Vilas Boas à Agência FAPESP.

O teste de RT-PCR específico para o MPXV foi desenvolvido no Hospital Israelita Albert Einstein pela equipe do médico João Renato Rebello Pinho, que também é pesquisador no IMT-USP. O método é o mesmo usado no diagnóstico da COVID-19 e de inúmeras outras doenças, mas cada patógeno requer reagentes específicos para que o material genético presente na amostra clínica possa ser amplificado e detectado em laboratório.

“Até aquele dia [10/06] nenhum centro do país tinha o kit de RT-PCR para esse vírus montado. Nós já havíamos estudado a sequência [de nucleotídeos complementar à do DNA viral, que é necessária para a amplificação do material genético durante o teste] e pedido para uma empresa nacional sintetizar. O que estava faltando era o controle positivo, que veio com o primeiro caso confirmado no país. É ele que garante que o teste está funcionando”, explica Pinho. “Assim como aconteceu no caso da COVID-19, está havendo uma grande colaboração entre instituições públicas e privadas, o que é fundamental.”

Após a confirmação de que o vírus que se multiplicava nas células vero era de fato o causador da varíola dos macacos, os passos seguintes foram extraí-lo do meio de cultura e inativá-lo para ser enviado com segurança a outros centros, explica Vilas Boas.

“As células infectadas morrem e liberam partículas virais no sobrenadante – o líquido rico em nutrientes no qual a cultura é mantida. Nós coletamos esse líquido e acrescentamos um reagente que inativa o vírus. Agora estamos enviando amostras desse material para laboratórios particulares e públicos que nos solicitaram. Nesses outros centros, o DNA viral poderá ser extraído e usado como controle positivo em testes de RT-PCR, expandindo a capacidade de testagem no país”, relata a virologista.

José Eduardo Levi, pesquisador do IMT-USP e da rede de laboratórios Dasa, explica que, de modo geral, são usadas nos testes de RT-PCR placas com 96 pequenos poços, nos quais podem ser colocadas amostras clínicas de até 94 indivíduos com suspeita da doença. Os outros dois poços são destinados aos controles positivo e negativo, necessários para a validação dos resultados.

“Como controle negativo podemos usar apenas água ou o sobrenadante coletado das culturas de células sem nenhum vírus. O mais difícil quando temos de lidar com um patógeno novo é conseguir o controle positivo. Sem ele não podemos ter certeza de que o teste de RT-PCR está de fato funcionando”, diz Levi.

Segundo o pesquisador, apesar dos avanços, a escassez de reagentes específicos para o MPXV no país ainda é um grande gargalo para que possa ser feita a testagem em massa da população, caso ela venha a ser necessária.

“Quando um laboratório dos Estados Unidos faz o pedido de reagentes, ele recebe no dia seguinte, pois há empresas especializadas na produção desses insumos. Aqui no Brasil demora pelo menos um mês, pois é preciso importar. No Dasa fizemos a encomenda no início de junho e ainda nada”, diz.

Produção em larga escala

Alguns centros equipados com a infraestrutura de biossegurança necessária estão recebendo do IMT-USP amostras do vírus ainda capaz de infectar células e de se replicar, como é o caso do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da USP. Assim como o SARS-CoV-2, o PMXV só pode ser manipulado em laboratórios com nível 3 de biossegurança (NB3).

“Nossa função vai ser cultivar o vírus em uma escala maior e dentro de duas ou três semanas começar a distribuir alíquotas para laboratórios de todo o país. Isso será possível graças a um acordo que fizemos no início da pandemia de COVID-19 com o Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovações [MCTI] e com os Correios. A empresa faz o transporte especializado das amostras. Retiram aqui e levam até a porta dos destinatários”, conta o professor do ICB-USP Edison Luiz Durigon.

O laboratório do ICB-USP integra a RedeVírus – criada pelo MCTI em fevereiro de 2020 para assessorar a pasta sobre estratégias na área de ciência, tecnologia e inovação necessárias na área de saúde – e foi o responsável por produzir o SARS-CoV-2 em larga escala e distribuir amostras para centros de diagnóstico e de pesquisas do país.

A equipe tem vasta experiência nesse tipo de trabalho e tem desempenhado papel fundamental em sucessivas crises sanitárias. “O trabalho começou por volta de 2003, com a criação da Rede de Diversidade Genética de Vírus [VGDN], financiada pela FAPESP. Na época cultivamos e distribuímos o SARS-CoV-1 [causador da síndrome respiratória aguda grave]. Em 2005 fizemos um trabalho com o influenza [causador da gripe] e depois, em 2015, veio o vírus zika. Recebemos a amostra do zika em dezembro do Instituto Evandro Chagas de Belém [PA] e com recursos de projetos da FAPESP cultivamos e distribuímos para diversos laboratórios. Com a chegada do novo coronavírus e o acordo com o MCTI conseguimos ampliar a escala de trabalho”, conta.

Duringon ressalta que o trabalho só foi possível porque o laboratório já contava com os recursos materiais e humanos necessários. “Eu já tinha pessoal treinado, que foram bolsistas de doutorado e de mestrado da FAPESP. Se partíssemos do zero, levaria pelo menos um ano para começar a funcionar. É preciso haver uma estrutura montada e financiamento contínuo para que se possa dar uma resposta rápida a agravos de saúde pública, como uma pandemia.”

Agora, além de cultivar o MPXV em larga escala, o grupo de Durigon também fará o sequenciamento de algumas amostras para verificar se há diferenças em relação ao vírus inicialmente isolado no país. “O cenário que estou antevendo é que, na maioria dos casos, distribuiremos alíquotas do vírus inativado para serem usados como controle positivo em laboratórios de diagnóstico. Somente para alguns centros com laboratório NB3 enviaremos amostras do vírus viável para pesquisas”, diz o professor do ICB-USP.

Na avaliação da professora da USP Ester Sabino, que coordenou o primeiro sequenciamento genômico do MPXV no país, este é mais um exemplo de como a universidade pública pode contribuir com sua capacidade instalada em situações de crise. “O isolamento viral é importante não só para a produção de controles positivos como também para a avaliação de novos fármacos”, afirma.

Pinho ressalta a importância de virologistas de todo o país trabalharem juntos, em rede, e também a necessidade de mais investimento em ciência.

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O feito tornou-se possível graças à adaptação para o MPXV de uma técnica de metagenômica rápida desenvolvida durante o doutorado de Ingra Morales Claro, bolsista da FAPESP. O trabalho foi coordenado pela professora da Universidade de São Paulo (USP) Ester Sabino, que também esteve à frente do primeiro sequenciamento de SARS-CoV-2 no país, em março de 2020, e dos primeiros casos da nova variante gama, surgidos em Manaus cerca de um ano depois (leia mais em: agencia.fapesp.br/32637/ e agencia.fapesp.br/35290/).

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A equipe do CADDE divulgou os resultados ontem (09/06) no virological.org, site em que virologistas de todo o mundo compartilham informações sobre patógenos de interesse em tempo real.

“Recebemos a amostra de um paciente internado no Hospital Emílio Ribas às 16 horas de terça-feira [07/06] e às 10 horas da manhã seguinte o genoma do vírus, que tem quase 200 mil pares de bases [bem mais que as 30 mil do SARS-CoV-2], estava sequenciado e analisado. A metodologia que desenvolvemos é, em média, 45% mais rápida do que as técnicas de metagenômica convencionais. E o custo também é menor, podendo chegar a US$ 30 por amostra”, conta Claro à Agência FAPESP.

Como explica Sabino, os cientistas costumam recorrer a análises metagenômicas quando precisam identificar um novo vírus emergente (como foi o caso do SARS-CoV-2 em 2019) ou detectar em amostras de pacientes um vírus já conhecido sem ter em mãos os reagentes específicos necessários (como ocorre agora com o MPXV).

Isso porque o teste de RT-PCR, padrão-ouro para diagnóstico da COVID-19 e de várias outras doenças, requer os chamados primers (iniciadores), que são sequências de nucleotídeos complementares às sequências virais que iniciam a replicação do material genético. E o resultado depois precisa ser comparado com controles negativos e positivos.

“Quando tem início uma epidemia por um agente infeccioso novo, um dos grandes gargalos para o diagnóstico dos casos é a falta de primers específicos e de controles positivos. Essa técnica pode ser útil nessas situações, pois permite identificar patógenos ainda desconhecidos, para os quais não há reagentes”, explica Sabino.

E quanto mais cedo ocorre a detecção do caso “index” (o primeiro caso), maior a probabilidade de contenção de um vírus emergente, acrescenta Claro.

No caso da metagenômica são usados primers aleatórios (não específicos para um determinado vírus ou bactéria), que possibilitam sequenciar todo o material genético contido em uma amostra biológica, inclusive o do hospedeiro (humano, no caso) e de outros patógenos que ele eventualmente albergue. Em seguida, essas informações são analisadas por técnicas de bioinformática e comparadas com um painel de referências.

“Exatamente como foi feito com o MPXV. Os dados obtidos foram mapeados em uma sequência do vírus já disponível para estudos. E isso nos permitiu comprovar que se tratava do monkeypox”, diz Claro.

Encurtando caminhos

A confirmação oficial do primeiro caso brasileiro de varíola dos macacos foi feita ontem (09/06) pelo Instituto Adolfo Lutz. O laboratório de referência paulista conduziu a análise metagenômica em uma plataforma conhecida como Illumina, uma das tecnologias que tem sido usada para detectar o MPXV nos centros europeus e norte-americanos e considerada padrão-ouro. O sequenciamento por esse método leva em média 48 horas para ser concluído.

Já o grupo do CADDE usou um sequenciador portátil conhecido como MinION, da Oxford Nanopore Technologies, e fez adaptações no protocolo usado para sequenciar o vírus zika (a partir de 2015) e o SARS-CoV-2 (a partir de 2020), tornando-o mais rápido.

“Uma das vantagens deste novo protocolo é a redução no tempo de preparo da amostra para sequenciamento, que passa de 14 horas para 5h40 minutos”, relata Claro.

Como a taxa de erro é um pouco mais elevada que a da plataforma Illumina, a equipe do CADDE buscou gerar até 300 leituras (reads) redundantes para cada região do genoma viral. “Quando cobrimos diversas vezes a mesma região e encontramos o mesmo resultado, podemos ter certeza de que não se trata de um erro de leitura”, diz a pesquisadora.

O passo seguinte foi montar a árvore filogenética do MPXV isolado no Brasil. Para isso, a equipe do CADDE comparou a sequência obtida na USP com outras 102 divulgadas este ano por cientistas de países como Bélgica, Portugal, Reino Unido, Alemanha, Espanha e Estados Unidos. O objetivo foi mensurar o grau de similaridade entre as sequências, o que dá pistas sobre as relações evolutivas.

“Baixamos todos os genomas completos sequenciados em 2022 [até 09/06], alinhamos as sequências e montamos a árvore filogenética. Vimos que o MPXV detectado aqui se encaixa em um grande clado [grupo], o mesmo em que estão os vírus sequenciados na Europa e nos Estados Unidos. Quando comparamos com o genoma de referência do CDC [o Centro de Controle de Doenças norte-americano], atualizado em maio, observamos somente três mutações”, conta Claro.

A título de comparação, o primeiro genoma de MPXV sequenciado em 2022 apresentou 47 mutações em relação ao último caso até então descrito (em 2018, na África).

“O que essas mutações representam e se de alguma forma elas contribuíram para o aumento no número de casos é algo que ainda está sendo estudado por outros grupos de pesquisa. Nós aqui no CADDE vamos ficar de olho nos próximos casos. A ideia é continuar sequenciando para monitorar a evolução do vírus”, revela Claro.

Embora seja conhecido por causar a varíola dos macacos ou varíola símia, o MPXV é um vírus que infecta principalmente roedores na África. O patógeno integra a família Orthopoxvirus, a mesma do vírus da varíola humana, erradicada em 1980.

A doença geralmente começa com febre, fadiga, dor de cabeça, dores musculares, ou seja, sintomas inespecíficos e semelhantes aos de resfriado ou gripe. Alguns dias após o início da febre aparecem as lesões na pele, que contêm alta carga viral. A disseminação se dá pelo contato direto com as feridas ou com roupas, lençóis e toalhas usadas por alguém com as lesões na pele. Também pode ocorrer pela tosse ou espirro de pessoas infectadas.

Até o início deste ano, a infecção era comum apenas na África Central. Mas novos casos já foram detectados em 33 países, a maioria sem histórico prévio da doença.

Myrian Clark conversou com o médico sanitarista Gonçalo Vecina sobre a Varíola dos Macacos. Veja a entrevista completa:

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